基因敲除小鼠，基因敲除小鼠模型建立

基因敲除小鼠，作为现代生物医学研究中不可或缺的工具，其模型建立过程涉及到多个关键步骤和科学原理。以下是对这一过程的详细解析。

经典基因敲除技术

基因敲除技术是一种利用DNA重组原理对特定基因进行永久性删除的方法。这种方法在研究基因功能、疾病机制等方面具有重要作用。

条件性敲除与敲入小鼠模型

条件性敲除和敲入小鼠模型是基因敲除技术的两种重要形式。条件性敲除允许在特定细胞类型或发育阶段进行基因敲除，而敲入小鼠模型则用于引入外源基因。

敲除盒的设计

敲除盒的设计是基因敲除的关键步骤。为了提高敲除效率，可以在载体中加入同源臂，并设计包含抗性基因或报告基因的敲除盒。敲除盒两侧应包含目标基因上、下游约500-1000的同源臂。

CRISR/Cas9与同源重组

CRISR/Cas9技术与同源重组结合，是实现基因敲除的有效手段。通过CRISR/Cas9系统，可以精确地切割目标基因，然后利用同源重组修复机制，将敲除序列整合到基因组中。

建立小鼠肿瘤模型

通过基因敲除技术建立小鼠肿瘤模型主要包括以下步骤：

1.设计并合成基因敲除模板：这个模板包含同源臂和基因敲除序列。

2.构建敲除载体：将同源臂与选择标记（如抗生素抗性基因）一起克隆到载体上。

3.转化：将敲除载体转化到芽孢杆菌中，通过同源重组在目标基因处插入外源片段。

4.筛选：利用选择标记筛选出成功敲除的细胞。

常规杂交瘤融合技术

常规杂交瘤融合技术是将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞在EG作用下融合，形成杂交瘤细胞。电融合技术则是在电脉冲场作用下实现细胞融合。

重组载体导入胚胎干细胞

将重组载体通过电穿孔法或显微注射导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，从而将DNA序列整合到内源基因组中。

基因敲除动物模型构建步骤

基因敲除动物模型构建步骤如下：

1.基因载体的构建：将目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如neo基因）的载体上。

2.转化：将载体转化到胚胎干细胞中。

3.胚胎移植：将转化后的胚胎移植到代孕母鼠中。

4.筛选：对出生的小鼠进行筛选，以确定是否成功敲除了目标基因。

基因敲除小鼠的优点与缺点

与其他类型敲除小鼠相比，全身敲除小鼠模型构建周期短，交配流程简单。但其缺点包括基因纯合敲除后容易导致小鼠胚胎期***或出生后***，以及可能引发其他基因的代偿，导致基因敲除后没有明显表型改变。